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雷火亚洲电竞平台官网-SP2/0-AG14小鼠骨髓瘤贴壁细胞系的培养与应用!

2023-09-28


1、布景SP20-AG14小鼠骨髓瘤贴壁细胞系是由绵羊红细胞免疫的BA LB/c小鼠脾细胞和P3X 63A g8骨髓瘤细胞融会获得的。Sp2/0-A g14细胞不排泄免疫球卵白,对20μg/ml的8-氮鸟嘌呤有抗性,对H A T比力敏感;Sp2/0-A g14细胞可以作为细胞融会时的B细胞组分用在制备杂交瘤;鼠痘病毒阴性。2、细胞培育操作步调1、SP20-AG14小鼠骨髓瘤贴壁细胞系培育基和培育冻存前提预备:1)预备DMEM(保举iCell-0001)培育基;优良胎牛血清,10%;双抗,1%。2)留意:圆形,悬浮发展,不要用力奏乐(发展时会沉到瓶底)3)SP20-AG14小鼠骨髓瘤贴壁细胞系培育前提:气相:空气,95%;二氧化碳,5%。温度:37摄氏度,培育箱湿度为70%-80%。4)冻存液:90%血清,10%DMSO,现用现配。2、SP20-AG14小鼠骨髓瘤贴壁细胞系细胞处置:1)冻存细胞的苏醒:将含有1mL细胞悬液的冻存管在37℃水浴中敏捷摇摆解冻,插手到含4-6mL完全培育基的离心管中夹杂平均。在1000RPM前提下离心3-5min,弃去上清液,完全培育基重悬细胞。然后将细胞悬液插手含6-8ml完全培育基的培育瓶(或皿)中37℃培育留宿。第二天显微镜下不雅察细胞发展环境和细胞密度。2)SP20-AG14小鼠骨髓瘤贴壁细胞系细胞传代:假如细胞密度达70%-90%,便可进行传代培育。该细胞稍微贴壁和悬浮培育的细胞,传代可以参考以下方式:1.搜集:将培育瓶中的悬浮的细胞搜集到离心管中。用不含钙、镁离子的PBS润洗细胞1-2次。因为细胞贴壁不牢PBS润洗后细胞会脱落所以PBS也要收受接管到离心管中。2.雷火app官网下载插手0.25%(w/v)雷火电竞网站官网胰卵白酶-0.53 mM EDTA在培育瓶中(T25瓶1-2mL,T75瓶2-3mL)置在37℃培育箱中消化1-2分钟(难消化的细胞可以恰当耽误消化时候),然后在显微镜下不雅察细胞消化环境,若细胞年夜部门变圆并脱落敏捷拿回操作台,轻敲几下培育瓶后插手3-4ml含10%FBS的培育基来终止消化。3.将搜集到的悬浮细胞、pbs清洗液中的细胞和消化下来的贴壁细胞以1000rpml离心5min,弃去上清,补加1-2mL培育液后重悬混匀后将细胞悬液按1:2的比例分到新T25瓶中,添加6-8ml依照仿单要求设置装备摆设的新的完全培育基以连结细胞的发展活力,后续传代按照现实环境按1:2~1:5的比例进行。3)SP20-AG14小鼠骨髓瘤贴壁细胞系细胞冻存:收到细胞后建议在培育前3代时冻存一批细胞种子以备后续尝试利用。3、利用SP20-AG14小鼠骨髓瘤贴壁细胞系可以用在鸭圆环病毒Cap卵白单克隆抗体和免疫胶体金试纸条的研制:以Cap卵白为研究对象,制备单克隆抗体,研发快速检测DuCV的胶体金免疫试纸条,实现DuCV的快速诊断与防治。本研究中去除DuCV Cap的N端审定位序列(Nuclear localization signals,NLS),即去除Cap基因的5′端1-108 bp区域,保存残剩的109-774 bp区域,N端引入His标签,以便在抗原的纯化,最后将核酸序列克隆到年夜肠杆菌表达质粒p ET-28a中,质粒定名为p ET-28a-Cap,并转化到年夜肠杆菌BL21菌株中使Cap卵白可以或许高效的表达。终究得以肯定其最好引诱表达前提为在终浓度0.1 m M IPTG引诱剂中37℃引诱3 h,重组Cap卵白首要以包容体情势获得表达。利用弗氏佐剂制备的重组DuCV Cap卵白免疫2只Balb/c雌性小鼠,ELISA检测2只小鼠的血清抗体效价均在1:20480,知足细胞融会的要求,分手提取免疫小鼠脾脏细胞和sp2/0细胞进行细胞融会,ELISA方式挑选可以或许排泄抗DuCV Cap卵白的特异性抗体的阳性孔并进行亚克隆,终究取得了可以或许不变排泄抗DuCV Cap卵白的一株杂交瘤细胞株6A1。Western bolt成果显示,6A1株单克隆抗体可以和重组DuCV Cap卵白和自然DuCV Cap卵白能产生特异性的连系。对单抗6A1的Ig G类型判定成果注解6A1的Ig G类型为Ig G1亚类和Kappa轻链。将6A1杂交瘤细胞株打针到雌性Balb/c小鼠的腹腔用以年夜量制备单克隆抗体,间接ELISA检测成果注解打针杂交瘤细胞株雷火电竞网站官网入口小鼠腹水的抗体效价可达1:102400。同时,用弗氏佐剂制备的重组DuCV Cap卵白疫苗对2只健康新西兰兔进行免疫,制备抗DuCV Cap卵白多克隆抗体,经3次免疫7天后利用间接ELISA方式检测兔血清的抗体效价,成果显示两只兔血清的抗体效价均到达了1:163840,经Western blot判定,该兔多抗对重组DuCV Cap卵白和自然DuCV Cap卵白均能产生特异性的连系。颠末Protein A+G对小鼠腹水和兔血清进行抗体纯化,取得了高纯度的鼠抗DuCV Cap卵白的单克隆抗体和兔抗多克隆抗体。进而以纯化的兔抗DuCV Cap卵白多克隆抗体作为T线(2 mg/m L),纯化的鼠6A1单克隆抗体(64μg/m L,p H 8.0)作为胶体金标识表记标帜抗体,以羊抗鼠Ig G(1 mg/m L)作为C线,组装胶体金检测试纸条。该DuCV抗原胶体金免疫层析试纸条在检测MDPV、GPV、DPV、NDV、AIV、DHV、FAd V和DRV中均不产生交叉反映,试纸条特异性杰出,检测抗原的敏感度可达15.6μg/m L。在39份的疑似传染鸭样品的检测中,别离用本次研究制备的胶体金试纸条与传统的PCR两种方式进行检测,检测成果合适率可达94.9%,检测成果正确度较高,同时经屡次测试都注解试纸条有较好的反复性和不变性,可以或许在10 min内完成对样品的快速检测。总之,本次研究制备的基在DuCV Cap卵白单克隆抗体的胶体金抗原检测试纸条可以实现快速、特异地检测临床样本中的DuCV,可用在DuCV的下层诊断和筛查工作。北京百欧博伟生物手艺有限公司的微生物菌种查询网供给微生物菌种收藏、测序、采办等办事,是中国微生物菌种收藏中间的办事平台,而且是集微生物菌种、菌种,ATCC菌种、细胞、培育基为一体的年夜型微生物查询类网站,自设装备和手艺的微生物菌种收藏中间!接待泛博客户来询!下载附件-雷火电竞网站



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